《细胞》重磅回顾：这些年兴起的大牛技术

还记得CRISPR-Cas9基因组编辑技术，cryo-EM，甚至高通量测序技术未出现之前，我们是怎样进行研究的吗？其实大家不用回忆太久，因为这不是很久以前的事。在过去几年间，生物学研究技术进步步伐快的让人难以置信。

Cell出版社旗下Molecular Cell杂志推出了技术特刊，介绍了新技术的发展，以及这些技术对研究和临床医疗的影响。一整期的内容都在描述功能强大的新兴工具技术，回望我们已经走过的路，以及未来即将要踏上的征程。其中有十一篇综述性文章介绍了近年来的重头技术。

高通量测序技术

人类基因组测序技术正在彻底改变我们对于生物学，人类多样性以及疾病的理解。从第一份测序草图，到个人基因组与基因组医学时代的到来，几乎都来自过去十年间DNA测序技术的飞跃发展。“High-Throughput Sequencing Technologies”探讨了常用高通量测序平台的发展，相关的检测方法，以及目前测序平台及其临床应用所面临的问题。

其中尤为值得注意的是近期Oxford Nanopore公司的掌上测序仪MinION早期试用项目的结果，一些大学的研究团队发表了使用MinION获得的研究成果，比如英国东安格利亚大学的研究人员用MinION鉴定了一种多重耐药菌的抗性基因。这项研究表明，这一技术能够很好的用于传染病诊断。研究人员指出，低成本速度快的纳米孔测序与短读取测序结合，能够为人们提供组装完全的细菌基因组，相信公共卫生机构和临床实验室很快就能从中获益。此外，纳米孔测序系统经过进一步改良之后，将不再需要短读取数据。

单细胞测序技术的进展与应用

单细胞测序（SCS）是研究稀少细胞，解析复杂组分的重要工具。在过去五年间，DNA和RNA方面的SCS技术对包括微生物学、神经生物学、发育生物学、组织嵌体、免疫学和癌症研究等诸多领域都产生了广泛的影响。“Advances and Applications of Single-Cell Sequencing Technologies”讨论了SCS技术，和其在转化医学中的应用。

比如来自加州大学的研究人员利用最新技术分析单个细胞中的基因活性，确定了发育大脑中细胞的独特特性。他们使用的技术主要集中在一个“微流体”设备，在这个设备中单个细胞被捕获并流入纳米级的小室中，那里它们有效而精确地进行DNA测序所必需的化学反应。研究表明，确定和拼出独特序列，并成功地确定细胞类型所需要的阅读步骤数量，比原先估计的少100倍。这项技术，是由Fluidigm公司开发，可同时用于96个细胞的单独过程。

单细胞RNA测序技术

单细胞生物和多细胞生物中单个细胞之间的差别都会产生重要的功能影响。近期研发的单细胞mRNA测序方法能帮助科学家们无偏向性，高通量，和高分辨率的解析这些单细胞。

这种方法相较于针对批量种群细胞的传统方法，为转录组学提出了更多的维度。目前单细胞RNA测序技术已经揭示了生物组织、转录动力学、基因之间调控关系的重要新机制。细胞捕获、细胞分型、分子生物学和生物信息学快速的技术发展为未来生物学和医学上的应用铺平了道路。

近期EMBL研发了一种可以在细胞分辨率上同时检测成千上万个基因的新技术，研究人员使用单细胞RNA-seq，扩大海洋蠕虫（Platynereis dumerilii）的大脑基因表达图谱。这种方法方法可让研究人员匹配定量数据和空间数据，将标记提高了几个数量级，这些标记可显示一个组织中的特定细胞类型。因此，一个更广泛的模式可能开始出现。

同时Affymetrix eBioscience也推出了第一个可同时检测单细胞水平的RNA和蛋白质表达的技术平台：PrimeFlow RNA Assay。这一技术的主要优势在于当相应蛋白质的流式抗体表现不佳或无法获得时，能高度灵敏地检测mRNA，此外，随着人们逐渐认识到非编码RNA的关键功能作用，直接测定异质细胞群中非编码RNA也将是一个趋势。

Fluidigm公司也在美国神经科学学会的会议上宣布推出一个新流程，能实现高通量的单细胞mRNA测序。这个流程综合了集成流体通路（IFC）设计的显着进步，可大规模提高通量和易用性，同时降低单细胞制备的成本。

设计特殊细胞类型全基因组实验

多细胞生物需要各种特殊的细胞类型进行分化来维持生存。这些细胞有其特殊的发育过程，和对环境挑战不同的应对方式，而这些都是通过相同的遗传图纸来指导完成的。因此现代生物学的一个关键问题就是了解这些基因如何在正确的位置上，在正常的时间里，表达正常的水平量，而且在许多疾病中，这种精细的基因表达调控 会被扰乱。因此了解这些意义重大。

“Designing Cell-Type-Specific Genome-wide Experiments”综述指出，近期一些新兴技术能利用细胞类型特异性方法，捕捉全基因组范围内基因表达，这些新技术帮助研究人员以前所未有的清晰度来了解体内的基因调控，让我们对多细胞生物如何适应环境有了更深的理解。这篇文章探讨了如何从最开始的材料，筛选合适的对照，验证数据，设计自己的特殊细胞类型实验。

荧光蛋白探针

光学成像和基因工程研究方面的进展推动了生物可视化新技术的发展。目前一些像是基于荧光蛋白FPs的遗传编码指示因子可以用于对离子、分子和酶的活动进行成像，正如钱永健Roger Tsien所说的，“在细胞中上演碟中谍”，这些指示因子能进入特殊的组织、细胞类型或亚细胞结构中，报告它们特殊的细胞内活动。

“Molecular Spies for Bioimaging—Fluorescent Protein-Based Probes”这篇综述概括了目前的单分子报告因子，这些因子能将蛋白的构象变化转换成荧光信号，许多报告因子都可以用于荧光共振能量转移和单FP方法。

去年同一时期，来自瑞士洛桑联邦理工学院的一组研究人员开发了一种可以很容易地进入活细胞的新荧光分子，这种分子无毒且具有持久的信号，最重要的是，可提供前所未有的图像分辨率。

这种探针，称为SiR-微管蛋白和SiR-肌动蛋白，被用来可视化人类皮肤细胞中的细胞骨架动态。因为探针的光信号是以远红光发射，所以很容易将它从背景噪声中分离出来，当使用一种称为超分辨率显微镜的技术时，会产生前所未有的高分辨率图像。

单细胞水平上的活细胞结构和动态成像

观察活细胞分子进程是定量了解生物学系统功能的一种重要方法，尤其是在单分子水平上解码细胞复杂行为有助于我们理解动力学，转运，和自组装过程。

在过去十年间，荧光显微技术，荧光相关光谱和荧光标记技术的快速发展令我们能以高分辨率观察不同分子作用机制的复杂性和随机性。“Imaging Live-Cell Dynamics and Structure at the Single-Molecule Level”这篇综述探讨了单分子水平活细胞结构和功能成像新概念和技巧。

定位泛素信号

泛素（UB）信号系统在生物体内十分常见，也常常与其他类型的翻译后修饰（PTMs），如磷酸化共同作用。但是至今我们对于这种信号途径的动力学机制和限速中间体了解的很少。

“Quantifying Ubiquitin Signaling”这一文章回顾了过往如何利用定量蛋白质组学工具，以及富集策略分析泛素信号系统，如何将这一信号途径与调控磷酸化事件，PINK1/PARKIN途径联系在一起。同时泛素化作用的一个关键特点是找到泛素途径链对下游进程的调控方式。这篇文章也描述了如何利用蛋白质组学和酶学工具识别和定量分析泛素链合成过程，以及关联倾向。文章指出，制定定量蛋白质组学将能为解析泛素信号途径生化机制提出一个新的标准。

今年一项新研究发现了泛素的新作用：泛素化有着与蛋白降解无关的另一种功能，可以帮助细胞抵御压力。研究显示，一种特殊的泛素化（K63）能够修饰并稳定核糖体，而核糖体是蛋白合成的发动机。研究人员发现，阻止酵母建立K63泛素链，会使蛋白产量大幅削减，结果细胞对压力条件高度敏感。研究人员是在酵母中研究K63泛素链的，不过这种泛素化也出现在小鼠的神经元。这说明泛素化的新机制也存在于哺乳动物中，很可能与人类健康有关。

Cryo-EM：独特的大分子复合物研究工具

3D低温电子显微镜（cryo-EM）虽然是结构生物学研究中的重要工具，但其潜力还未充分发挥出来，近期这一技术分辨率获得了一个飞跃性发展，在生物学系统中应用也越来越多。由于这一技术并不要求一定要结晶，样品量需要的也少，而且可以在计算机中成像分类，因此cryo-EM可以用于处理许多复杂构象成分的混合物。

“Cryo-EM： A Unique Tool for the Visualization of Macromolecular Complexity”综述介绍了这一技术单颗粒分析的主要原则，并探讨了近期这一技术应用的关键问题。而且文章还特别强调了一些目前正在进行的新技术，其中许多将能实现之前无法完成的分辨率“梦之队”。

美国国立癌症研究所NCI近期达到了cryo-EM成像迄今为止的最高分辨率（2.2 ？），此前只有X射线晶体衍射达到过这种水平的分辨率。这能为人们提供足够的结构信息，进行更好的药物研发。

定义代谢的大小，流量和调控

过去二十年里代谢研究促进了代谢技术的爆炸性发展，首当其冲的就是具有“非定标性（untargeted metabolomics，生物通译）”和“探索性”的代谢组学方法（metabolomics），这种技术的实验目标是全面衡量整个代谢，其中涉及大量未定义的分子组。由于代谢组学的全覆盖性，因此对于寻找某个代谢研究问题答案的科学家来说，这成为了第一选择。但是找到非定标性代谢组学也不一定就是最佳实验选择，传统方法中非定标性代谢组学只能提供代谢池尺寸相对差异的信息。因此这还是取决于各自研究的项目，稳定同位素（stable-isotope）检测方法也是不错的选择。

“Defining the Metabolome： Size， Flux， and Regulation”详细介绍了这方面的内容。

癌细胞图谱项目：寻找癌症的特征网络

DNA测序技术进步帮助科学家们发现了癌症基因组中成千上万的体细胞突变，展现了癌细胞令人惊讶的复杂性，但是目前还尚不清楚哪些是促进癌症发生发展的关键驱动突变，哪些是被动突变，以及这些突变对于发病机制的影响，对治疗的应答反应。

虽然相似类型的肿瘤和临床疗效也许会告诉我们突变作用模式截然不同，但是显然这些突变确实具有一些相同的分子途径和网络作用特征。因此要想成功解释癌症基因组，就需要全面了解致癌发生过程中选择性压力的分子网络。

“The Cancer Cell Map Initiative： Defining the Hallmark Networks of Cancer”这篇文章宣布了这一研究方向的又一重要举措：癌细胞图谱项目（CCMI），这一项目主要旨在系统地详细说明癌基因之间的复杂关联，以及它们在疾病和健康状态下的差异。文章也探讨了近期这方面的成果，以及其对精密医学的影响。